Rotamer-Free Protein Sequence Design Based on Deep Learning and Self-Consistency

论文地址： https://www.nature.com/articles/s43588-022-00273-6

中国科大用深度学习实现高实验成功率的蛋白质序列从头设计

中国科学技术大学生命科学与医学部刘海燕教授、陈泉副教授团队与信息科学技术学院李厚强教授团队合作,开发了一种基于深度学习为给定主链结构从头设计氨基酸序列的算法ABACUS-R，在实验验证中，ABACUS-R的设计成功率和设计精度超过了原有统计能量模型ABACUS。相关成果以“Rotamer-Free Protein Sequence Design Based on Deep Learning and Self-Consistency”为题于北京时间2022年7月21日发表于Nature Computational Science。

刘海燕教授、陈泉副教授团队致力于发展数据驱动的蛋白质设计方法，建立并实验验证了利用神经网络能量函数从头设计主链结构的SCUBA模型，以及对给定主链结构设计氨基酸序列的统计能量函数ABACUS。然而，通过优化能量函数来进行序列设计的方法在成功率、计算效率等方面仍有不足。近期有多项研究表明，用深度学习进行氨基酸序列设计能够在天然氨基酸残基类型恢复率等计算指标上超过能量函数方法；但截至目前已正式发表的工作中，对相关方法的实验验证结果远未达到能量函数方法的成功率。该论文报道的ABACUS-R模型，则不仅在计算指标上超过ABACUS，在实验验证中成功率和结构精度也有大幅提高。

用ABACUS-R进行序列设计的方法由两部分组成（图1）。第一部分为预训练的编码器-解码器网络：该网络用Transformer把中心氨基酸残基的化学和空间结构环境映射为隐空间表示向量，再用多层感知机网络将该向量解码为包括中心残基氨基酸类型在内的多种真实特征（图1a）。在方法的第二部分，经用非冗余天然蛋白序列结构数据训练后，ABACUS-R编码器-解码器被用于给定主链结构的全部或部分氨基酸序列从头设计。具体为：从任意初始序列出发，对各个类型待定残基分别应用ABACUS-R编码器-解码器，得到环境依赖的最适宜残基类型，并反复迭代至不同位点的残基类型最大程度自洽（图1b）。

图1. 用ABACUS-R模型进行蛋白质序列设计的原理。(a) 预训练的编码器-解码器网络；(b)采用自洽迭代策略进行全序列从头设计。

ABACUS-R方法包含两部分：（1）一个encoder-decoder网络被预训练用以推断给定骨架的局部环境时中心残基的侧链类型（2）用该encoder-decoder网络连续更新每个残基的类型，最终收敛获得自洽（self-consistent）。网络的输入是中心残基与空间上最邻近（C_α间距离）k个残基组成的局部结构。邻近残基的特征包含空间层面的相对位置与取向信息（X_SPA）、序列层面的相对位置信息（X_RSP）以及邻近残基的残基类型（X_AA）。第i个中心残基的特征包含全零的X_SPA、被mask的X_AA以及骨架上的15个ϕ_i₋₂, ψ_i₋₂, ω_i₋₂ ⋯ ϕ_i₊₂, ψ_i₊₂, ω_i₊₂，这些特征组合起来会被映射到与邻近残基特征相同的维度。以上模型输入的信息都是旋转平移不变的。局部结构中的所有残基的特征经过可学习的映射后融合后，得到每个残基总特征En。{E_n; n = 0, 1, 2, … , k}经过基于 transformer架构的encoder-decoder，预测每个中心残基的类型以及其他辅助任务。

自洽迭代设计的方法是：对序列随机初始化，第一轮随机选择80%的残基通过encoder-decoder并行预测其残基类型，以后每轮随机选择的残基数目逐渐下降。最终的设计结果会逐渐收敛。

在理论验证的基础上，中国科大团队尝试了实验表征用ABACUS-R对3个天然主链结构重新设计的57条序列；其中86%的序列（49条）可溶表达并能折叠为稳定单体；实验解析的5个高分辨晶体结构与目标结构高度一致（主链原子位置均方根位移在1Å以下）(图2)。此外，与以前报道的从头设计蛋白相似，ABACUS-R从头设计的蛋白表现出超高热稳定性，去折叠温度大多可达100℃以上。

作者将PDB中的非冗余结构按照两种不同的方式划分了95%作为训练集、5%作为测试集，第一种划分方式确保测试集的结构不会存在训练集中出现过的CATH拓扑，训练得到的模型为Model_eval;第二种划分方式时随机划分Model_final。Model_eval可以用来评估模型能力的无偏向性的表现，而Model_final使用了更丰富的数据训练表现应当更好。

表现评估

Encoder-decoder的架构可以进行多任务学习，除了训练序列的恢复的任务以外，还可以预测二级结构、SASA、B-factor与侧链扭转角χ₁、χ₂。多个任务可以增强模型设计序列的能力（图2a），Model_eval与Model_final都可以在测试集上最好取得50%左右准确度。在测试集上的结果显示，虽然有些残基类型没有恢复正确，但是模型也学习到了替换为性质相似的残基（图2b）。

相较于ABACUS模型，ABACUS-R序列设计更高的成功率和结构精度进一步增强了数据驱动蛋白质从头设计方法的实用性。ABACUS-R还提供了一种对蛋白质局部结构信息的预训练表示方式，可用于序列设计以外的其他任务。

Decoder网络输出的是每个位置上残基类型的-logP，类似于选择不同残基对应的能量，所以作者将ProTherm数据集中蛋白突变的ΔΔG与模型计算出相应的−ΔΔlogits进行了比较，发现二者有一定的相关性（图2d），说明模型一定程度上学习到了能量。

接着，作者验证了模型的自洽性，测试集中100个蛋白属于CATH的三个大类，对其中的每个蛋白从随机序列出发设计10条序列，随着迭代的次数变多，平均-logP会趋于收敛（图3a），同时未收敛的残基比例也会收敛（图3b）。不同CATH类别的骨架上取得的序列恢复率差距不大（图3c）。同一蛋白骨架设计出的序列会有很高的相似性（0.76-0.89）。设计出的序列与天然序列相比，序列的成分高度相似（图3d），Pearson相关系数达到了0.93，但GLU、ALA与LYS出现得更频繁，而Gln、His、Met出现得更少。此外，ABACUS-R设计出的序列与ABACUS设计出的序列相比，平均每个残基的Rosetta打分更低（图3e），而平均的-logP打分却更高（图3f），这意味着ABACUS-R学习到的能量与Rosetta打分函数存在正交的部分。

图3. ABACUS-R的自洽能力、设计能力以及学习到的能量与Rosetta打分的比较

相较于其他深度学习方法在单个残基恢复任务上的表现，ABACUS-R超过了除DenseCPD外的所有方法（表1），在整条序列重设计任务上ABACUS-R在两个测试集上都取得了最好的表现

实验验证

最后，作者在3种天然骨架（PDB ID: 1r26, 1cy5 and 1ubq）上通过实验验证了ABACUS-R的设计能力。设计的方法有两种：第一种采用迭代自洽的设计方法（生成序列的多样性低），第二种采用迭代时对decoder输出结果进行采样（生成序列的多样性高，但-logP能量也略高）。

第一种方法设计的27条序列有26条成功表达，体积排阻色谱与¹H NMR实验结果显示所有的蛋白都以单体形式存在，示差扫描量热实验显示5条序列有很好的热稳定性（ 97~117 ^∘C ）。最终，1r26的3个设计与1cy5的1个设计成功解出了晶体结构，C_α RMSD位于0.51~0.88 Å，而1ubq的1个设计虽然没有解出结构，但已有的实验结果显示它折叠成了明确的三维结构。

第二种方法对同一骨架设计的序列相似度在58%左右。30条设计的序列中，25条被成功表达，23条能被可溶地纯化。所有设计同样都是单体存在并且折叠成了明确的三维结构，5个设计有很好的热稳定性（85~118 ^∘C）。最终，1r26的1个设计被成功解出了晶体结构，C_αRMSD为0.67 Å。相较方法一的自洽设计，方法二设计成功率下降，成功设计的蛋白热稳定性也略微下降，但作者认为可以接受。

最后，作者展示了所有1r26设计晶体结构核心的侧链pack（图4a,b），以及 1cy5设计晶体结构的侧链的极性作用（图4c），说明了ABACUS-R学会了设计侧链的组合以pack好的结构。

用语言模型学习表示蛋白质的功能特性

以数据为中心的方法已被用于开发用于阐明蛋白质未表征特性的预测方法；然而，研究表明，这些方法应进一步改进，以有效解决生物医学和生物技术中的关键问题，这可以通过更好地代表手头的数据来实现。新的数据表示方法主要从在自然语言处理方面取得突破性改进的语言模型中汲取灵感。最近，这些方法已应用于蛋白质科学领域，并在提取复杂的序列-结构-功能关系方面显示出非常有希望的结果。在这项研究中，土耳其中东科技大学（Middle East Technical University）的研究人员，首先对每种方法进行分类/解释，然后对它们的预测性能进行基准测试，对蛋白质表示学习进行了详细调查：（1）蛋白质之间的语义相似性，（2）基于本体的蛋白质功能，（3）药物靶蛋白家族和（4）突变后蛋白质-蛋白质结合亲和力的变化。这项研究的结论将有助于研究人员将基于机器/深度学习的表示技术应用于蛋白质数据以进行各种预测任务，并激发新方法的发展。该研究以「Learning functional properties of proteins with language models」为题，于 2022 年 3 月 21 日发布在《Nature Machine Intelligence》。

蛋白质科学是一门广泛的学科，它通过实验室实验（即蛋白质组学）和计算方法（例如分子建模、机器学习、数据科学）分析单个蛋白质以及生物体的整个蛋白质组，最终创建准确且可重复使用的方法用于生物医学和生物技术。蛋白质信息学可以定义为蛋白质科学的计算和以数据为中心的分支，通过它对蛋白质的定量方面进行建模。蛋白质的功能表征对于开发新的有效的生物医学策略和生物技术产品至关重要。截至 2021 年 5 月，UniProt 蛋白质序列和注释知识库中约有 2.15 亿条蛋白质条目；然而，其中只有 56 万份（约 0.26%）由专家手动审查和注释，这表明当前的排序（数据生产）和注释（标签）能力之间存在很大差距。这种差距主要是由于从湿实验室实验及其手动管理中获得结果的成本较高，同时具有时间密集性。为了补充基于实验和管理的注释，使用计算机方法势在必行。在这种情况下，许多研究小组一直致力于开发新的计算方法来预测蛋白质的酶活性、生物物理特性、蛋白质和配体相互作用、三维结构以及最终的功能。蛋白质功能预测（PFP）可以定义为自动或半自动地将功能定义分配给蛋白质。生物分子功能的主要术语被编入基因本体论（GO）系统；这是一个概念的分层网络，用于注释基因和蛋白质的分子功能，以及它们的亚细胞定位和它们所涉及的生物过程。PFP 最全面的基准项目是功能注释的关键评估（CAFA）挑战；在该项目中，参与者预测一组目标蛋白的基于 GO 的功能关联，这些目标蛋白的功能后来通过手动调节确定，用于评估参与预测因子的性能；迄今为止的 CAFA 挑战表明，PFP 仍然是一个开放的问题。以前的研究已经表明，复杂的计算问题，其中特征是高维的并且具有复杂/非线性关系，适合基于深度学习的技术。这些技术可以有效地从嘈杂的高维输入数据中学习与任务相关的表示。因此，深度学习已成功应用于计算机视觉、自然语言处理和生命科学等各个领域。生物分子的特征（例如，基因、蛋白质、RNA 等）应被提取并编码为定量/数值向量（即表示），以用于基于机器/深度学习的预测建模。给定生物分子的原始和高维输入特征，表示模型将该特征向量计算为该生物分子的简洁和正交表示。经过优化训练的监督预测系统可以有效地学习数据集中样本的特征，并使用这些表示作为输入来执行预测任务（例如，序列上的 DNA 结合区域、生化特性、亚细胞定位等）。蛋白质表示方法可以分为两大类；（1）经典表示（即模型驱动的方法），使用预定义的属性规则生成，例如基因/蛋白质之间的进化关系或氨基酸的物理化学性质，以及（2）数据驱动的表示，使用统计和机器学习算法（例如人工神经网络）构建，这些算法针对预定义任务进行训练，例如预测序列上的下一个氨基酸。之后，训练模型的输出——即表示特征向量——可以用于其他与蛋白质信息学相关的任务，例如功能预测。从这个意义上说，表示学习模型利用了知识从一个任务到另一个任务的转移。这个过程的广义形式被称为迁移学习，据报道它在时间和成本方面是一种高效的数据分析方法。因此，蛋白质表示学习模型最大限度地减少了对数据标记的需求。蛋白质表示学习是一个年轻但高度活跃的研究领域，主要受到自然语言处理 (NLP) 方法的启发。因此，蛋白质表示学习方法在文献中经常被称为蛋白质语言模型。之前的研究表明，各种蛋白质表示学习方法，尤其是那些结合了深度学习的方法，已经成功地提取了蛋白质的相关固有特征。参见：https://www.nature.com/articles/s42256-022-00457-9/tables/1尽管有研究评估学习的蛋白质表示模型，但需要进行全面的调查和基准测试，以便在学习蛋白质的多个方面（包括基于本体的功能定义、语义关系、家族和相互作用）的背景下系统地评估这些方法。在新的研究中，中东科技大学的研究人员对自 2015 年以来提出的可用蛋白质表示学习方法进行了全面调查，并通过详细的基准分析测量了这些方法捕获蛋白质功能特性的潜力。涵盖了经典和基于人工学习的方法，并深入了解了它们各自代表蛋白质的方法。研究人员根据它们的技术特征和应用对这些方法进行分类。为了评估每个表示模型在多大程度上捕获了功能信息的不同方面，该团队构建并应用了基于以下的基准：(1) 蛋白质之间的语义相似性推断，(2) 基于本体的 PFP，(3) 药物靶蛋白家族分类，(4) 蛋白质-蛋白质结合亲和力估计。

图示：研究的示意图。（来源：论文）此外，该团队还提供了相关的基准测试软件（Protein Representation Benchmark, PROBE），它允许人们轻松评估任何表示方法在该团队定义的四个基准测试任务中的性能。研究人员希望该工作能够，为希望将基于机器/深度学习的表示技术，应用于生物分子数据进行预测建模的研究人员提供信息。也希望这项研究能够激发新的想法，以开发新颖、复杂和强大的以数据为中心的方法来解决蛋白质科学中的开放问题。基于表示学习的方法在蛋白质功能分析中的表现通常优于经典方法在该团队所有的基准测试中，观察到学习表示（尤其是大型模型）在预测性能方面优于经典模型，证实了基于人工学习的数据驱动方法在表示生物分子的功能特性方面的优势。另一方面，在 PFP 预测基准的分子功能类别中，HMMER 是一种基于隐马尔可夫模型（HMM）的生物分子相似性检测和功能注释的经典方法，可以与基于深度学习的蛋白质表示方法竞争。该结果与先前的研究一致，即序列相似性与蛋白质的生化特性高度相关，以至于使用此特征的简单矢量表示几乎可以执行复杂的序列建模方法。鉴于这些结果，研究人员表示，将同源信息明确纳入表征学习模型的训练可能会导致考虑到预测性能的改进。这从基于深度学习的高性能蛋白质结构预测器（例如 RoseTTAFold 和 AlphaFold2）中也很明显，它们使用多个序列比对来显着丰富基于序列的输入。他们认为，在当前状态下，学习到的蛋白质表示对于其他原因也是必不可少的。模型设计和训练数据类型/来源是表征学习的关键因素蛋白质表征学习中最关键的因素之一是表征模型的设计。例如，在这里的基准测试中，包含了两种类型的 BERT 模型。TAPE-BERT-PFAM 接受了 3200 万个蛋白质结构域序列的训练。ProtBERT-BFD 训练有 21 亿个宏基因组序列片段；然而，这两者之间的性能差异是微不足道的。另一方面，使用相同 2.1B 数据集（例如 ProtT5-XL）训练的更复杂的模型在大多数基准测试中表现出更好的性能。因此，研究人员认为模型设计/架构是最重要的（与这些方法的设计/架构相关的信息在方法中给出，并在结果部分就预测性能进行了讨论）。关于训练数据源的另一个发现是，合并多种数据类型可能会在与功能相关的预测任务中带来更好的性能。例如，AAC 和 APAAC 都使用氨基酸组成；然而，APAAC 还在其表示模型中添加了物理化学特性，并且在语义相似性推断和 PFP 基准测试中表现得更好。同样，Mut2Vec 结合了突变配置文件、PPI 和文本数据，并取得了最佳性能；尤其是在语义相似性推理基准测试中。在蛋白质表征学习方法的构建和评估过程中应考虑潜在的数据泄漏数据泄漏可以定义为机器学习方法的训练和验证阶段之间的知识意外泄漏，导致性能测量过于乐观，是性能测试期间应考虑的关键问题。研究人员分析发现，某些表示模型在与这些模型预训练的任务生物学相关的任务中表现良好；尽管数据和实际任务彼此不同。蛋白质表征学习的现状和挑战蛋白质表示学习领域存在一些挑战。尽管大多数蛋白质表示学习模型（迄今为止提出的）都是源自 NLP 模型（基于 LSTM/transformer 的深度学习模型），但建模语言和蛋白质的问题之间存在结构差异。据估计，一个以美国为母语的成年英语使用者，平均使用 46,200 个词条和多词表达；然而，蛋白质中只有 20 种不同的氨基酸，它们被表示模型以类似于语言的引理的方式处理。这些 NLP 模型为每个单词计算一个表示向量。类似地，当这种方法应用于蛋白质序列数据时，会为每个氨基酸计算一个表示向量。这些向量被汇集起来，为每个句子/文档和蛋白质创建固定大小的向量，分别用于 NLP 和蛋白质信息学任务。因此，与 NLP 相比，蛋白质表示中的少量构建块（即 20 个氨基酸）可能为较小的模型在与蛋白质表示学习领域中的较大模型竞争时带来优势。因此，鼓励对蛋白质序列特异性学习模型进行更多研究。

图示：蛋白质语义相似性推理基准结果。（来源：论文）模型的可解释性对于理解模型为何如此行事至关重要。在可解释表示中，所有特征都以隔离形式编码，这意味着向量上每个位置对应的特征是已知的；然而，该研究中研究的大多数学习蛋白质表示是不可解释/可解释的。例如，蛋白质中 TIM 桶结构的存在可能在其表示向量的第五位编码，而分子量信息可能在第三和第四位之间共享。一般来说，在数据科学领域，解缠结研究试图将样本的真实属性与输出向量的各个位置联系起来。蛋白质表征的解开是一个新课题，迄今为止只有少数表征模型开发人员探讨了这个问题。因此，尚不存在系统方法，并且需要新的框架来标准化评估蛋白质表示模型的可解释性。迄今为止提出的大多数蛋白质表示模型仅使用一种类型的数据（例如蛋白质序列）进行训练。然而，蛋白质知识与多种类型的生物信息相关，例如 PPI、翻译后修饰、基因/蛋白质（共）表达等；只有少数可用的蛋白质表示模型使用了多种类型的数据。在该团队的基准研究时所涉及的方法中，Mut2Vec 就是一个这样的例子，它结合了 PPI、突变和生物医学文本，并且比 GO BP 和基于 CC 的 PFP 中的许多仅基于序列的表示产生了更准确的结果。研究人员建议整合其他类型的蛋白质相关数据，尤其是进化关系，可能会进一步提高预测任务的准确性。MSA-Transformer 和无向图模型（例如 DeepSequence）通过深度学习利用同源信息。DeepSequence 使用 MSA 的后验分布计算潜在因子，而 MSA-Transformer 使用基于行和列的注意力来结合 MSA 和蛋白质语言模型。尽管 MSA-Transformer 在基准测试中表现出平均性能，但在之前的文献中，发现它在二级结构和接触预测任务上是成功的，这表明 MSA-Transformer 具有捕捉进化关系的能力。与此相关的是，文献中明确要求能够从广义的角度有效地表示蛋白质的整体蛋白质载体，用于各种不同的蛋白质信息学相关目的。研究人员认为，可以通过连接多个先前使用不同类型的生物数据独立构建的表示向量来创建这些整体表示，并使用这些向量的集成版本训练新模型以用于高级监督任务，例如预测生物过程和/或复杂的结构特征。构建这些整体表示的另一种方法是通过图表示学习直接学习整合多种蛋白质关系（例如，其他蛋白质、配体、疾病、表型、功能、途径等）的异构图。

图示：基于本体的蛋白质功能预测基准结果。（来源：论文）蛋白质表示学习方法可用于设计新蛋白质蛋白质设计是生物技术的主要挑战之一。合理的蛋白质设计涉及评估许多不同替代序列/结构的活性和功能，以为实验验证提供最有希望的候选者，这可以看作是一个优化问题。为此目的要探索的序列空间是巨大的。例如，人类蛋白质的平均长度约为 350 个氨基酸，其中存在 20^350 种不同的组合，尽管其中大多数是非功能性序列。在过去的几十年中，计算方法已被用于蛋白质设计，并且这些方法已经产生了有希望的结果，特别是在酶设计、蛋白质折叠和组装以及蛋白质表面设计方面。因此已经开发出高效的抗体和生物传感器。其中一些方法使用量子力学计算、分子动力学和统计力学，每种方法的计算成本都非常高，并且需要专业知识。类似的缺点也表现在主流的蛋白质设计软件，如 Rosetta。最近的研究表明，基于人工学习的生成建模可用于从头蛋白质设计。在机器学习领域，生成建模与判别建模相反，是一种生成合成样本的方法，这些样本服从从真实样本中学习到的概率分布。这是通过有效地学习训练数据集中样本的表示来实现的。

图示：药物靶蛋白家族分类基准结果。（来源：论文）深度学习最近已成为生成模型架构的关键方法，并已应用于包括蛋白质/肽设计在内的各个领域。例如，Madani 团队使用蛋白质语言模型从头开始设计属于不同蛋白质家族的新功能蛋白质，并通过湿实验室实验验证了他们的设计。这些研究表明，表示学习对于蛋白质和配体（药物）设计中的新应用至关重要。

图示：蛋白质-蛋白质结合亲和力估计基准结果。（来源：论文）研究人员相信蛋白质表示学习方法将在不久的将来对蛋白质科学的各个领域产生影响，并在现实世界中应用，这要归功于它们在输入级别集成异构蛋白质数据（即理化性质/属性、功能注释等）的灵活性，以及它们有效提取复杂潜在特征的能力。论文链接：https://www.nature.com/articles/s42256-022-00457-9

AlphaFold2蛋白质结构预测

摘自机器学习算法工程师

科学界已知的几乎所有蛋白质结构，都在这里了。蛋白质是生命的基础构件，它们由氨基酸链组成，折叠成不同的复杂形状。蛋白质的功能通常由其 3D 结构决定。如果我们了解蛋白质的折叠方式，就可以开始探索它们是如何工作的，并尝试改变它们的功能。尽管 DNA 提供了制造氨基酸链的指令，但预测它们如何相互作用以形成蛋白质的 3D 结构是一个巨大的挑战。
一年前，DeepMind 发布了 AlphaFold2，以原子水平的准确度预测了 2/3 的蛋白质结构，并与 EMBL-EBI 共同发布了开放可搜索的蛋白质结构数据库 AlphaFold DB，与世界共同分享这一技术。
7 月 28 日，DeepMind 宣布 AlphaFold DB 已从 100 万个结构扩展到超过 2 亿个结构，扩大超过 200 倍，这一进展将极大地提升人们对于生物学的理解。
几乎涵盖所有已知蛋白质
「你可以认为它基本涵盖了所有蛋白质结构。包括植物、细菌、动物和许多其他生物的预测结构，这为 AlphaFold 开辟了巨大的新机会，可以对环保、粮食安全和被忽视疾病等重要问题产生影响，」DeepMind 创始人、首席执行官杰米斯 · 哈萨比斯在介绍 AlphaFold DB 这次扩展时说道。

这一更新包括植物、细菌、动物和其他生物的蛋白质预测结构。

这一更新意味着蛋白质数据库 UniProt 都将带有蛋白质预测结构（UniProt 是一个全面的，高质量的，免费使用的蛋白质序列与功能信息数据库，它还包含了大量来自研究文献的关于蛋白的生物学功能信息）。研究者可以通过 Google Cloud Public Datasets 批量下载，让世界各地的科学家更容易访问 AlphaFold。
斯克里普斯转化研究所创始人 Eric Topol 表示：「AlphaFold 是生命科学领域独一无二的重大进步，展示了 AI 的力量。过去确定蛋白质的 3D 结构需要数月或数年，现在只需几秒钟。AlphaFold 已经加速并实现了大规模发现，包括破解核孔复合体的结构。新的蛋白质结构不断增加，几乎照亮了整个蛋白质宇宙，我们可以期待每天都有更多的生物谜团被解开。」
AlphaFold 的影响
自发布至今，AlphaFold 已产生令人难以置信的影响。它是 DeepMind 构建的最复杂的人工智能系统，需要多项关键创新，并已应用到多种下游任务中。
AlphaFold2 可以在原子精度上准确地预测蛋白质的结构，它不仅为生物学中 50 年来的重大挑战提供了解决方案，也证明了：人工智能可以极大地加速科学发现，进而推动人类进步，这一点意义重大。
DeepMind 已经开源了 AlphaFold 的代码，并在《自然》杂志上发表了两篇深度论文，引用量已超过 4000。此外，DeepMind 还与 EMBL-EBI 合作设计了一种帮助生物学家使用 AlphaFold 的工具，并共同发布了 AlphaFold DB。
在发布 AlphaFold 之前，DeepMind 征求了 30 多名生物学研究专家的意见，使得他们以最大化潜在利益和最小化潜在风险的方式与世界分享 AlphaFold 。

迄今为止，来自 190 个国家 / 地区的超过 500000 名研究人员访问了 AlphaFold DB，查看了超过 200 万个结构。一些免费提供的蛋白质结构也已集成到其他公共数据集中，例如 Ensembl、UniProt 和 OpenTargets，被数百万用户访问。

在与其他机构合作时，DeepMind 优先考虑那些最具积极社会效益的应用，重点关注那些资金不足或被忽视的计划。
拼凑核孔复合体
在最新一期《科学》杂志特刊上，几个研究团队描述了 AlphaFold 帮助拼凑核孔复合体——生物学中最具挑战性的难题之一。这个巨大的结构由数百个蛋白质部分组成，控制着进出细胞核的一切。

人们通过使用现有的实验方法揭示它的轮廓，结合 AlphaFold 预测完成和解释其中不清楚的区域，最终揭示了它的微妙结构。《科学》将其称为实验结构生物学的胜利，这种新研究方式现在正成为实验室的常规做法，开启了新的科学研究道路。
结构搜索工具
Foldseek、Dali 等结构搜索工具允许用户非常快速地搜索与给定蛋白质相似的结构。这将是为实际有用的蛋白质（例如分解塑料的蛋白质）挖掘大型序列数据集的第一步，它可以提供有关蛋白质功能的线索。
对人类健康的影响
AlphaFold 已经对人类健康产生了重大而直接的影响。与欧洲人类遗传学会的合作证明 AlphaFold 对于解开罕见遗传疾病的原因至关重要。此外，AlphaFold 还通过更好地了解新发现的可能成为药物靶点的蛋白质，帮助科学家更快地找到与其结合的潜在药物来加速药物发现。
参考内容：https://www.science.org/doi/10.1126/science.add2210https://www.theverge.com/2022/7/28/23280743/deepmind-alphafold-protein-database-alphabethttps://www.deepmind.com/blog/alphafold-reveals-the-structure-of-the-protein-universehttps://www.nature.com/articles/d41586-022-02083-2

AlphaFold2论文

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03819-2
https://github.com/deepmind/alphafold

沐神AlphaFold讲解

论文补充材料：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.10.04.463034v1

摘要

蛋白质对生命至关重要，了解它们的结构可以促进对其功能的系统理解。通过大量的实验，已经确定了大约 100,000 种独特的蛋白质结构，但这仅代表了数十亿已知蛋白质序列中的一小部分。

蛋白质结构是指蛋白质分子的空间结构。作为一类重要的生物大分子，蛋白质主要由碳、氢、氧、氮、硫等化学元素组成。所有蛋白质都是由20种不同的L型α氨基酸连接形成的多聚体，在形成蛋白质后，这些氨基酸又被称为残基。
蛋白质一级结构：组成蛋白质多肽链的线性氨基酸序列。
蛋白质二级结构：依靠不同氨基酸之间的C=O和N-H基团间的氢键形成的稳定结构，主要为α螺旋和β折叠。
蛋白质三级结构：通过多个二级结构元素在三维空间的排列所形成的一个蛋白质分子的三维结构。
蛋白质四级结构：用于描述由不同多肽链（亚基）间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子。

仅根据其氨基酸序列预测蛋白质的三级结构，这是“蛋白质折叠问题”, 50 多年来一直是一个重要的开放性研究问题。尽管最近取得了进展，但现有方法仍远未达到原子级准确度，尤其是当没有可用的同源结构时。

同源结构，那些不同物种因来自共同祖先而具有的相似性结构。例如现代马经较长时间的修饰成为具有一个趾，鼹鼠及其他洞穴动物成为瘤状肢体，大象的肢体成为柱状，这样功能各异的前肢有一个共同来源，他们都来自原始陆生脊椎动物五趾型的肢体。

在这里，我们提供了第一种计算方法，即使在不知道相似结构的情况下，它也可以以原子精度定期预测蛋白质结构。我们在具有挑战性的第 14 次蛋白质结构预测关键评估 (CASP14) 中验证了我们基于神经网络模型的完全重新设计的AlphaFold，在大多数情况下表现出与实验相媲美的准确性，并且大大优于其他方法。支持最新版本的 AlphaFold 是一种新颖的机器学习方法，它将关于蛋白质结构的物理和生物学知识，利用多序列比对，融入深度学习算法的设计中。

序列比对指将两个或多个序列排列在一起，标明其相似之处。序列中可以插入间隔（通常用短横线“-”表示）。对应的相同或相似的符号（在核酸中是A, T(或U), C, G，在蛋白质中是氨基酸残基的单字母表示）排列在同一列上。
tcctctgcctctgccatcat—caaccccaaagt
|||| ||| ||||| ||||| ||||||||||||
tcctgtgcatctgcaatcatgggcaaccccaaagt
多序列比对是成对比对的延伸，是为了在一次比对里面处理多于两条的的序列。多序列比对方法试图比对一个指定序列集合里面的所有序列，这可以帮助确定这些序列的共同区段。进行多序列比对有几种方法，最常用的一种是Clustal程序集，它使用渐进多序列比对算法。Clustal在cladistics中被用来建立进化树，在PSI-BLAST和Hidden Markov model (HMM)中用来建立序列档案以在序列数据库中搜索更远的同源序列。

从蛋白质序列预测蛋白质3D结构的计算方法的发展沿着两条互补的路径前进，分别关注物理相互作用或进化历史。物理相互作用方案将我们认知的分子驱动力（molecular driving forces）整合到物理热力学或动力学模拟或统计模型逼近中。虽然理论上非常吸引人，但由于分子模拟的计算难度、蛋白质稳定性的上下文依赖性以及难以产生足够准确的蛋白质物理学模型，这种方法已被证明对即使是中等大小的蛋白质也极具挑战性。近年来，进化方案提供了一种替代方案，其中蛋白质结构约束来自蛋白质进化历史的生物信息学分析、与已解决结构的同源性和成对进化相关性。

这种生物信息学方法极大地受益于蛋白质数据库 (PDB) 中存储的实验蛋白质结构的稳定增长、基因组测序的爆炸式增长以及用于解释这些相关性的深度学习技术的快速发展。尽管取得了这些进展，基于物理和进化历史的方法产生的预测远低于实验准确性。

我们（DeepMind团队）开发了第一个能够在大多数情况下预测蛋白质结构接近实验准确性的计算方法。我们开发的神经网络 AlphaFold 已进入 CASP14 评估（2020 年 5 月至 7 月）。 CASP 评估每两年进行一次，使用未在 PDB 中存放或公开披露的最近解决的结构，因此它是对参与方法的盲测，长期以来一直作为结构预测准确性的金标准评估。

蛋白质结构预测 (CASP) 实验的批判性评估旨在建立蛋白质结构预测的当前技术水平，确定已取得的进展，并突出未来可能最有成效的工作重点。

… 省略了部分内容

在图 2a 中证明，CASP14 中展示AlphaFold的高准确率扩展到最近大量PDB结构样本，其中所有结构在我们的训练数据截止后都存储在PDB中，并作为完整链进行分析。此外，当主链预测准确时，观察到高侧链准确性（图 2b），并且表明我们预测的局部距离差异测试（pLDDT）置信度可靠地预测了 Ca 局部距离差异测试（lDDT-Cα）准确度相应的预测（图 2c）。我们还发现可以准确估计全局叠加度量模板建模分数 (TM-score)（图 2d）。总体而言，这些验证了 AlphaFold 在 CASP14 蛋白上的高精度和可靠性也可以迁移到最近 PDB 提交的未经整理的数据集中。

Fig. 1 | AlphaFold produces highly accurate structures.

PDB蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,简称PDB)是美国Brookhaven国家实验室于1971年创建的，由结构生物信息学研究合作组织(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics,简称RCSB)维护。和核酸序列数据库一样，可以通过网络直接向PDB数据库提交数据。

AlphaFold网络

AlphaFold 通过结合基于蛋白质结构的进化、物理和几何约束的新型神经网络架构和训练程序，大大提高了结构预测的准确性。特别是，我们展示了一种联合嵌入多序列比对 (MSA) 和成对特征的新架构、一种新的输出表示和相关损失函数，可实现准确的端到端结构预测、新的等变注意架构、使用中间损失函数来实现预测的迭代改进，屏蔽 MSA 损失与结构联合训练，使用自蒸馏从未标记的蛋白质序列中学习，以及自我估计准确率。

蒸馏，就是知识蒸馏，将教师网络(teacher network)的知识迁移到学生网络(student network)上，使得学生网络的性能表现如教师网络一般；或者大型模型迁移到小型模型中，小型模型的参数规模小，运行速度快，但性能与大型模型参不多。

AlphaFold 网络使用一级氨基酸序列和同源物的比对序列作为输入，直接预测给定蛋白质的所有重原子的 3-D 坐标（图 1e，请参阅方法了解输入的详细信息，包括数据库、MSA 构建和使用的模板）。最重要的方法和组件的描述如下在附件中提供了完整的网络架构和训练过程在附件的方法章节中。

该网络包括两个主要阶段。首先，网络的主干通过我们称为 Evoformer 的新型神经网络块的重复层处理输入，以生成 Nseq × Nres 数组（Nseq：序列数，Nres：残基数），表示已处理的 MSA 和 Nres × Nres 数组，表示残基对。 MSA 表示是用原始 MSA 初始化的，但请参阅附件-方法 1.2.7 了解处理非常深的 MSA 的详细信息。 Evoformer 块包含许多新颖的基于注意力和非基于注意力的组件。我们在“可解释性”部分展示了证据，表明在 Evoformer 块中早期出现了具体的结构假设并不断完善。 Evoformer 模块的关键创新是在 MSA 内交换信息的新机制和允许直接推理空间和进化关系的配对表示。

网络的主干之后是结构模块，该模块以蛋白质的每个残基（全局刚体框架）的旋转和平移的形式引入了明确的 3-D 结构。这些表示在简单的状态下初始化，所有旋转设置为一致，所有位置设置为原点，但快速发展和完善，具有精确原子细节的高度准确的蛋白质结构。网络这一部分的关键创新包括打破链原子结构以允许同时对结构的所有部分进行局部细化，一种新颖的等变变换器允许网络隐式推理未表示的侧链原子，以及一个损失项代替残基的方向正确性的重要权重。在结构模块和整个网络中，我们通过反复将最终损失函数应用于输出，然后将输出递归地提供给相同的模块来强化迭代细化的概念。使用整个网络的迭代细化（我们称之为“循环”) 对准确性有显着贡献，而额外的训练时间很少（有关详细信息，请参阅附件-方法-1.8）。

Evoformer模块

名为 Evoformer（图 1e 和 3a）的网络构建块的关键原理是将蛋白质结构预测视为 3-D 空间中的图推理问题，其中图的边缘由邻近的残基定义。配对表示的元素编码有关残基之间关系的信息（图 3b）。 MSA 表示的列编码输入序列的各个残基，而行表示这些残基出现的序列。在这个框架内，我们定义了许多更新操作，这些更新操作应用于每个块中，其中不同的更新操作被串联应用。

Fig. 3 | Architectural details.

MSA 表示通过在 MSA 序列维度上求和的逐元素外积更新配对表示。 与之前的工作不同，此操作应用于每个块中，而不是在网络中应用一次，这使得从不断发展的 MSA 表示到配对表示的连续通信成为可能。

在配对表示中，有两种不同的更新模式。两者都受到配对表示一致性必要性的启发——为了将氨基酸的配对描述表示为单个 3-D 结构，必须满足许多约束，包括距离上的三角不等式。基于这种直觉，我们根据涉及三个不同节点的边三角形来安排对表示的更新操作（图 3c）。特别是，我们向轴向注意力添加了一个额外的 logit 偏差，以包括三角形的“缺失边”，并且我们定义了一个非注意力更新操作“三角形乘法更新”，它使用两条边来更新缺失的第三条边（参见附件-方法-1.6.5 了解详情）。三角形乘法更新最初是作为注意力更对称且更便宜的替代品而开发的，仅使用注意力或乘法更新的网络都能够产生高精度结构。然而，两个更新的组合更准确。

我们还在 MSA 表示中使用了一种轴向注意力的变体。在 MSA 中的 per-sequence attention 期间，我们从 pair stack 中投射额外的 logits 以偏置 MSA attention。这通过提供从配对表示返回到 MSA 表示的信息流来关闭循环，确保整个 Evoformer 模块能够完全混合对和 MSA 表示之间的信息，并为结构模块中的结构生成做好准备。

端到端结构预测

结构模块（图 3d）使用对表示和来自主干的 MSA 表示的原始序列行（“single representation”，“单一表示”）在具体的 3-D 主干结构上运行。 3-D 主干结构表示为 Nres 独立的旋转和平移，每个旋转和平移相对于全局框架（residue gas，“残余气”？，图 3e）。这些旋转和平移，代表 N-Cα-C 原子的几何形状，优先考虑蛋白质骨架的方向，以便每个残基的侧链位置在该框架内受到高度限制。相反，肽键几何形状完全不受约束，并且在应用结构模块期间观察到网络经常违反链约束，因为打破此约束允许对链的所有部分进行局部细化，而无需解决复杂的闭环问题。在微调期间通过违规损失项鼓励满足肽键几何形状。只有在 Amber力场中的梯度下降结构的预测后松弛中才能实现肽键几何形状的精确执行。根据经验，这种最终松弛不会提高模型的准确性，如通过全局距离测试 (GDT) 或 IDDT-Cα34 测量的，但确实消除了分散注意力的立体化学违规而不会损失准确性。

AMBER力场是在生物大分子的模拟计算领域有着广泛应用的一个分子力场。AMBER力场的优势在于对生物大分子的计算，其对小分子体系的计算结果常常不能令人满意。

residue gas表示分两个阶段迭代更新（图 3d）。首先，我们称为不变点注意力 ( Point Attention) 的新型几何感知注意操作用于更新 Nres 神经激活集（single representation，“单一表示”）而不改变 3-D 位置，然后对residue gas使用更新的激活。不变点注意力通过在每个残基的局部框架中产生的 3-D 点来增强每个通常的注意力查询、键和值，这样最终值对全局旋转和平移是不变的（参见方法“不变点注意力（IPA）”了解详情)。 3-D 查询和键也对注意力施加了强烈的空间/局部性偏差，这非常适合蛋白质结构的迭代细化。在每个注意力操作和逐元素转换块之后，该模块计算每个主干帧的旋转和平移的更新。这些更新在每个残差的局部框架内的应用使得整体注意力和更新块成为对residue gas的等变操作。

侧链 chi 角的预测以及结构的最终每个残基精度 (pLDDT) 是在网络末端的最终激活上使用小的每个残基网络计算的。 TM 分数 (pTM) 的估计值是从成对错误预测中获得的，该预测被计算为最终对表示的线性投影。最后的损失（我们称之为帧对齐点误差（FAPE）（图 3f））将预测的原子位置与许多不同对齐下的真实位置进行比较。对于每个对齐，通过将预测帧 (Rk,tk) 对齐到相应的真实帧来定义，我们计算所有预测原子位置 xi 与真实原子位置的距离。由此产生的 Nframes × Natoms 距离受到限制的 L1 损失的惩罚。这对原子相对于每个残基的局部框架是正确的产生了强烈的偏见，因此在其侧链相互作用方面是正确的，并为 AlphaFold 提供了手性的主要来源（增刊-方法 1.9.3 和增刊-图 9)

使用标记和未标记数据进行训练

AlphaFold 架构能够仅使用对 PDB 数据的监督学习来训练到高精度，但我们能够使用类似于noisy-student自我蒸馏的方法来提高准确性（见图 4a）。在这个过程中，我们使用一个训练有素的网络来预测来自 Uniclust30的约 350,000 个不同序列的结构，并将预测结构的新数据集过滤为高置信度子集。然后，我们使用 PDB 和这个新的预测结构数据集的混合作为训练数据从头开始训练相同的架构，其中各种训练数据增强（例如裁剪和 MSA 子采样）使网络难以重现先前预测的结构。这种自蒸馏过程有效地利用了未标记的序列数据，并显着提高了所得网络的准确性。

Self-training是最简单的半监督方法之一，其主要思想是找到一种方法，用未标记的数据集来扩充已标记的数据集。算法流程如下：
（1）首先，利用已标记的数据来训练一个好的模型，然后使用这个模型对未标记的数据进行标记。
（2）然后，进行伪标签的生成，因为我们知道，已训练好的模型对未标记数据的所有预测都不可能都是好的，因此对于经典的Self-training，通常是使用分数阈值过滤部分预测，以选择出未标记数据的预测标签的一个子集。
（3）其次，将生成的伪标签与原始的标记数据相结合，并在合并后数据上进行联合训练。
（4）整个过程可以重复n次，直到达到收敛。

此外，我们随机屏蔽或突变 MSA 中的单个残基，并具有来自 Transformers (BERT) 式目标的双向编码器表示来预测 MSA 序列的屏蔽元素。这个目标鼓励网络学习解释系统发育和协变关系，而无需将特定的相关统计量硬编码到特征中。与最近的独立工作相比，BERT 目标是在相同的训练示例上与正常的 PDB 结构损失联合训练的，并且没有进行预训练。

解释神经网络

为了了解 AlphaFold 如何预测蛋白质结构，我们为网络中的 48 个 Evoformer 块中的每一个训练了一个单独的结构模块，同时保持主网络的所有参数保持不变（补充方法 1.14）。包括我们的回收阶段，这提供了 192 个中间结构的轨迹，每个完整的 Evoformer 块一个，其中每个中间体代表网络对该块最可能结构的信念。在前几个块之后产生的轨迹出奇地平滑，表明 AlphaFold 对结构进行了不断的增量改进，直到它不能再改进为止（见图 4b 的准确度轨迹）。这些轨迹也说明了网络深度的作用。对于非常具有挑战性的蛋白质，如 SARS-CoV-2 Orf8 (T1064)，网络搜索并重新排列多层的二级结构元素，然后再确定一个好的结构。对于 LmrP (T1024) 等其他蛋白质，网络会在前几层内找到最终结构。请参阅增刊-视频 1-4 的 CASP14 目标 T1024、T1044、T1064 和 T1091 的结构轨迹显示了一系列蛋白质大小和难度的清晰迭代构建过程。在补充-方法 1.16 和增刊-图12-13，我们解释了 AlphaFold 层产生的注意力图。

Fig. 4 | Interpreting the neural network

图 4a 包含 AlphaFold 组件的详细消融，表明各种不同的机制有助于 AlphaFold 的准确性。请参阅增刊-方法 1.13 详细描述了每个消融模型、它们的训练细节、消融结果的扩展讨论以及 MSA 深度对每次消融的影响（补充-图 10）。

MSA 深度和跨链接触

虽然 AlphaFold 在绝大多数沉积的 PDB 结构中具有很高的准确性，但我们注意到仍然存在影响准确性或限制模型适用性的因素。当平均比对深度小于约 30 个序列时，该模型使用多个序列比对，准确度大幅下降（详见图 5a）。我们观察到阈值效应，其中 MSA 深度超过约 100 个序列的改进导致小增益。我们假设需要 MSA 信息在网络的早期阶段粗略地找到正确的结构，但是将该预测细化为高精度模型并不关键取决于 MSA 信息。我们观察到的另一个实质性限制是，与异型接触的数量相比，AlphaFold 对于链内或同型接触很少的蛋白质要弱得多。这通常发生在较大复合物中的桥接结构域，其中蛋白质的形状几乎完全由与复合物中其他链的相互作用产生。相反，AlphaFold 通常能够为同聚体提供高精度预测，即使链基本上交织在一起（例如图 5b）。我们希望 AlphaFold 的想法很容易适用于预测未来系统中的完整异质复合物，并且这将消除具有大量异质接触的蛋白质链的困难。

Fig. 5 | Effect of MSA depth and cross-chain contacts.

讨论

我们在设计 AlphaFold 时采用的方法是生物信息学和物理方法的结合：我们使用物理和几何归纳偏差来构建组件，这些组件可以从 PDB 数据中学习，并最大限度地减少手工制作的特征（例如，AlphaFold 在没有氢的情况下有效地构建氢键债券评分函数）。这使得网络从 PDB 中的有限数据中更有效地学习，但能够应对结构数据的复杂性和多样性。特别是，AlphaFold 能够处理缺失的物理环境，并在具有挑战性的情况下生成准确的模型，例如交织的同源异构体或仅在未知血红素组存在时才会折叠的蛋白质。处理未指定结构条件的能力对于从 PDB 结构中学习至关重要，因为 PDB 代表了结构已被求解的所有条件。一般来说，AlphaFold 被训练产生最有可能作为 PDB 结构的一部分出现的蛋白质结构。在特定化学计量或配体/离子可单独从序列预测的情况下，AlphaFold 可能会产生一种隐式遵守这些约束的结构。

AlphaFold 已经向实验界展示了它的实用性，包括分子置换和解释低温电子显微镜 (cryo-EM) 图。此外，由于 AlphaFold 直接输出蛋白质坐标，因此 AlphaFold 会根据蛋白质序列的长度以图形处理单元 (GPU) 分钟到 GPU 小时生成预测（例如，对于 384 个残基，每个模型大约 1 个 GPU 分钟，请参阅方法了解详细信息）。这开辟了在蛋白质组规模及其他范围内预测结构的令人兴奋的可能性。

可用基因组测序技术和数据的爆炸式增长彻底改变了生物信息学，但实验结构测定的内在挑战阻止了我们结构知识的类似扩展。通过开发准确的蛋白质结构预测算法，再加上由实验社区组装的现有大型且精心准备的结构和序列数据库，我们希望加速结构生物信息学的进步，以跟上基因组学革命的步伐。我们希望 AlphaFold 以及将其技术应用于其他生物物理问题的计算方法将成为现代生物学的重要工具。

在线内容

任何方法、附加参考资料、自然研究报告摘要、源数据、扩展数据、补充信息、致谢、同行评审信息；作者贡献和竞争利益的详细信息；数据和代码可用性声明可在 Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold – Nature 上获得。

Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold – Nature

AI制药：分子对接

任务：

1、安装学习yutobe上面的软件

https://www.youtube.com/watch?v=Sux91FJ3Xe8&t=629s

2、跑通论文代码

https://www.youtube.com/watch?v=Sux91FJ3Xe8&t=629s

Pymol简介

Pymol是一款操作简单，功能强大的分子以及蛋白的可视化软件，由薛定谔公司研发，科研人员可以从官网申请最新教育版本，同时pymo的开源版（https://github.com/schrodinger/pymol-open-source），可以直接从网站上下载，但是版本较老。所以，根据需求选择版本进行下载。说明： https://cloud.tencent.com/developer/article/1785088

Pymol入门教程：

http://pymol.chenzhaoqiang.com/intro/startManual.html

分子对接教程

1、

https://cloud.tencent.com/developer/inventory/15332

2、https://www.bilibili.com/video/av466685164?from=search&seid=9870338638011316620&spm_id_from=333.337.0.0

vina只负责对接，mgltool负责提供蛋白质分子和配体分子。

先用MGL 生成vina需要的pdbqt文件

MGL tools的作用就是生成pdbqt文件

1、：打开MGL tools，打开受体蛋白的pdb ：file-》read molecule

2、蛋白质的pdb（数据库）：

关于蛋白质结构的PDB文件，做分子对接，估计大家都知道PDB这个蛋白质数据库啦。这里简单的介绍一下。

蛋白质的三级结构是指整条多肽链的三维空间结构，也就是包括碳骨架和侧链在内的所有原子的空间排列。第一个蛋白质的三维空间结构于 1958 年用 X-射线衍射法（X-ray Crystallography）测定。这种方法目前仍然是获取蛋白质三级结构的主要方法。PDB 数据库中绝大多数蛋白质结构都是用这种方法测定的。另一个测定蛋白质三维空间结构的方法是核磁共振法（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）。无法结晶的蛋白质，可以利用核磁共振法在液体环境中进行结构测定。但是核磁共振法只能用于质量小于 70 千道尔顿的分子，大约对应 200 个氨基酸的长度。除此之外，还有一些不太常用的方法也可以测定分子的三维空间结构，比如冷冻电子显微镜技术（Cyro-Electron Microscopy）。无论用什么方法测定的空间结构，都要提交到 PDB 数据库。所以我们获取蛋白质三级结构最直接的办法就是去PDB 搜索（http://www.rcsb.org/）。从PDB首页的搜索条里，可以通过搜索PDB ID、分子名称、作者姓名等关键词来查找蛋白质三级结构。此外，利用高级搜索工具，可以通过序列相似性搜索获得与输入序列在序列水平上相似的蛋白质的三级结构。搜索方法选 BLAST，输入序列，点击“Result Count”。这里不详细介绍，因为我们做分子对接，通常蛋白名称是已知的。我们重点介绍怎么选择合适的蛋白结构文件。比如我们搜索PI3K这个蛋白，直接在搜索栏搜索，结果是有很多的。可以看到有393个结构信息。首先我们可以通过左边的栏进行筛选，比如物种信息，我们选择人。当然，结果的显示排序可通过结果上面的选项卡进行选择不同的排序方式。我们筛选合适的蛋白结构，常用Score这个选项.我们选择分辨率较好的在前。这里的0.9Å，Å是光波长度和分子直径的常用计量单位，值越小，分辨率越高，结构越准确。页面往下拉，可以看见这个值越来越大，我们优先选择值小的。我们可以从页面里面看见一下基本信息，比如方法，物种以及被解析的时间等。这里5GJI这个结构获取的方法就是X-RAY。我们点击这个蛋白，进入后可以看见详细的信息。然后我们还要看这个蛋白的描述是不是我们想要的蛋白，从这里面感觉看起来比较费劲。这里我们借助uniprot这个数据库来选择是比较方便的。这里简单介绍一下这个数据库，可能有的同学是第一次知道。翻了多年前的笔记，粘贴在下面。 UniProt 数据库有三个层次。

第一层叫 UniParc，收录了所有 UniProt 数据库子库中的蛋白质序列，量大，粗糙。

第二层是 UniRef，他归纳了 UniProt 几个主要数据库并且是将重复序列去除后的数据库。

第三层是 UniProtKB，他有详细注释并与其他数据库有链接，分为 UniProtKB 下的 Swiss-Prot和 UniProtKB 下的 TrEMBL 数据库。

关系稍有点复杂，但实际上我们最常用的就是 UniProtKB下的 Swiss-Prot 数据库。

从 UniProt 数据库查看一条蛋白质序列（http://www.uniprot.org/）。在UniProt数据库的首页上有一个关于 UniProtKB 数据库的统计表。可以看到，TrEMBL 数据库里存储的序列数量远远大于 Swiss-Prot 中的。统计表里清楚的写着：TrEMBL 是自动注释的，没有经过检查，而 Swiss-Prot 是人工注释的，并且经过检查。

然后点击下载文件就可以直接下载PDB格式的蛋白结构文件。下载的PDB文件可以用pymol或者VMD观察结构。能够实现蛋白质三维结构可视化的软件非常多。比专业级的PyMOL（https://pymol.org/2/）。这个软件已经被世界上著名的生物医药软件公司“薛定谔公司（Schrödinger）”收购。这种专业级的可视化软件不仅能够做出非常漂亮的图片，它还有强大的插件支持各种各样的蛋白质结构分析，这款软件需要购买，如果你发表的文章里提到某些内容是使用PyMOL制作的，而文章中所有作者和作者单位都没有PyMOL的购买记录的话，你可能会面临薛定谔公司的追责。如果要对接的蛋白没有结构，我们又要对接，那就只能是自己通过软件预测了。蛋白质结构预测的方法有从头计算法，同源建模法，穿线法和综合法。常用的是同源建模法，SWISS-MODEL（www.swissmodel.expasy.org）就是一款用同源建模法预测蛋白质三级结构的全自动软件，这里不详细介绍了，预测的模型还要涉及模型好坏的评价，后续有时间，再介绍蛋白质三级结构的预测。

接下来我们打开AutoDockTools(ADT)，打开我们前面保存的文件1E8Y_PYMOL.pdb

删除水分子和其他配体，常规操作不用解释

然后计算电荷和添加原子类型

Edit–Charges–Compute Gasteiger

Edit–Atoms–Assign AD4 type

就可以导出成pbdqt格式的文件了

然后右键吧蛋白删除掉，导入配体小分子，随便从ZINC下了一个

ZINC(http://zinc.docking.org/) 还有一个数据库能下载mol2格式的文件。ZINC)，这里就不介绍了，你要是能从上面的数据库下载到你配体小分子的mol2格式文件，就直接用，如果不能，那就是去PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载sdf文件，然后进行转换，这也是我这里要介绍的。

Ligand-input-open

分子对接教程

1 分子对接的工作环境
1.1 对接基本需求
受体的 pdb 文件、知道配体的结构
1.2 对接软件
使用 AutoDock 进行对接，该软件由 AutoDock 和 MGLTools 两
部分组成，AutoDock 为主程序，仅提供了命令行接口，而 MGLTools
中的 AutoDockTools（ADT）可以看作是 AutoDock 的图形用户界面。
配体使用 ChemDraw 和 Chem3D 绘制，该软件为收费软件，可
使用其它免费的结构式绘制工具进行结构绘制，使用 Open Babel 转
3D 结构和文件格式的转换。
使用 PyMol 开源版本对受体蛋白的 pdb 文件进行处理。

2 准备受体、配体的 pdbqt 文件

AutoDock 只接受 pdbqt 格式的文件，所以需要通过
AutoDockTools 将 pdb 或者其他格式的文件转化为 pdbqt 文件。

2.1 准备受体的 pdbqt 文件
2.1.1 使用 PyMol 软件进行处理

pdb 下载的蛋白需要先使用 PyMol 软件删除多余的离子、水分
子，同源多聚体蛋白还可以只保留一条链。直接从 pdb 下载蛋白可以
使用 fetch [protein name]命令。导入后 pdb 文件后，点击右下角的 S
以显示结构信息、

2.1.2 关于 pdb 文件的格式

该格式省略了一切氢原子，包括游离的水分子都只保留了一个 O，所以后续需要加氢操作。该文件的格式较复杂，最好使用成熟的软件进行编辑，而不上自行编辑。该文件中的氨基酸残基的原子全部记录在 ATOM 行中，后面的每一项分别为原子序号、原子名称（第一个字母为原子的元素符号，第二个字母为远近标识符 A、B、G、D、E、Z、H 分别对应有机化合物命名系统中的 α、β、γ、δ、ε、ζ、η）、残基名称、链编号、残基序号、原子坐标等

而离子、水分子以及结合在蛋白中的配体（如抑制剂等）等非蛋白质的部分记录在 HETNAM（非标准残基的名称）中：

同样的依次是原子编号、原子名称、基团名称（如水这里起名为HOH）、链编号（但是它本身不依附于哪条链）、原子编号、坐标等。

2.1.3 使用 PyMol 命令进行选择和删除
选择也可以使用命令选择，select 命令可以用于选择链如：
select chain A
indicate 命令的格式则为 indicate [element_type] [name]，如根据残基
名称 HOH 选择所有的水分子：
indicate resname HOH
需要注意的是，选择水分子不要使用：
indicate name O
否则其会选中所有氨基酸残基中的氧原子。根据残基名称选择配体
Mr-Greyfun
（示例中配体名称为 STI）：
indicate resname STI
根据原子名称选择氯原子：
indicate name CL
可以使用 remove 命令进行删除操作，命令格式与之类似：
remove resname HOH
remove name CL
remove chain B

2.1.1 保存
在 PyMol 中完成上述处理后使用 Export Molecule-save 保存成pdb 格式的文件。
2.1.2 加氢操作
pdb 文件会省略氢原子，所以需要进行加氢，可以在 PyMol 中使用 h_add 命令加氢（删除为 remove hydrogen ），但最好使用AutoDockTools（ADT）进行加氢。处理好后的文件用 ADT 打开后，点击 Edit-Hydrogens-Add-OK。加氢。
2.1.3 转化为 pdbqt 格式的文件
点击 Grid-Macromolecule-Choose，选择好后点 select molecule，
它会自动加电荷等，点 OK 即可，完成后，会弹出保存窗口，直接保
存 pdbqt 格式即可

2.1.1 保存
在 PyMol 中完成上述处理后使用 Export Molecule-save 保存成
pdb 格式的文件。
2.1.2 加氢操作
pdb 文件会省略氢原子，所以需要进行加氢，可以在 PyMol 中使
用 h_add 命令加氢（删除为 remove hydrogen ），但最好使用
AutoDockTools（ADT）进行加氢。
处理好后的文件用 ADT 打开后，点击 Edit-Hydrogens-Add-OK。
加氢。
2.1.3 转化为 pdbqt 格式的文件
点击 Grid-Macromolecule-Choose，选择好后点 select molecule，
它会自动加电荷等，点 OK 即可，完成后，会弹出保存窗口，直接保
存 pdbqt 格式即可

设置好后点 Done，然后点击 Ligand-Output-Save as PDBQT 即可
保存。

2.2.1 附：用 PyMol 导出 pdb 文件中的配体的方法
在界面上选中小分子，点击(sele)的 A-copy to object-new。红框内
的区域可以点击后将其对应的对象隐藏起来：
然后点击 Export Molecule-save 保存成 pdb 格式的文件。注意，这个
内置的配体也是没有加氢的，需要用 ADT 加氢。

3 对接
3.1 对接操作步骤
3.1.1 导入受体和配体
在 ADT 里面，点击 Grid-Macromolecule-Open 打开受体蛋白
点击 Grid-Set-Map-Types-Open Ligand 打开受体的 pdbqt 文件
3.1.2 定义对接盒子
点击 Grid-Grid Box 定义对接盒子
3.1.3 生成 config.txt 文件
点击 Docking-Output-Vina config 生成 config.txt 文件
3.1.4 启动对接

视频中的步骤：

1、导入protein蛋白质

2、删除水分子如果你的对接区域有水分子，会影响对接结果

pdq该格式省略了一切氢原子，包括游离的水分子都只保留了一个 O，所以后续需要加氢操作。

3、edit ->hydrogens->add->polar only 此时结构中发亮的就是氢键（加氢）

4、加电荷 edit -> charges->add kollman charges

5 报存 grid -> macromolecule ->choose->select

准备配体文件：

以sdf结尾的文件直接拖进 AUTO软件中会报错，需要转换成pdb文件

可以使用pymol可视化工具转换(注意：配体英文 ligend)

1、将该文件拖动到pymol中打开，file ->molecule

配体文件：

1、打开auto dock，将配体文件导入：

2、点击 Ligand（配体）->input->choose (这一步就是生成了配体文件)

3、点击 Ligand（配体）->output->save as pdbqt

接下来就可以进行分子对接：

1、将两个（受体和配体）pdpqt导入

2、重新选择蛋白质分子作为受体

点击NO

接下来设置对接盒子：

grid -> grid box

设置盒子位置（spacing设置为1）

然后 grid box 弹出设置中选择 file->output grid dimensions file（保存盒子设置）

保存：

新建config.txt:用于启动vina

receptor 蛋白质名（生成的蛋白质文件名）

ligand 配体名

center 和size在上一步的grid中有

receptor：指定受体分子的路径

ligand：配体分子的路径

center_x，center_y，center_z：搜索空间中心的坐标

size_x，size_y，size_z：指定搜索空间的大小。这里设置的大小基本就是把整个受体分子都包含了，属于blind docking。如何更准确确定结合口袋的位置，我们稍后再说。

energy_range：默认4，与最优结合模型相差的最大能量值，单位是kcal/mol。比方说，最优模型的能量计算出来是-8.5kcal/mol，那么vina也就最多计算到-4.5kcal/mol的模型就终止了，也就意味着这个值决定了生成模型的最大个数。

exhaustiveness：用来控制对接的细致程度，默认值是8. 大致与时间成正比。

num_modes：最多生成多少个模型。实际生成的模型数由num_modes和energy_range共同决定。

energy_range

 maximum energy difference between the best binding 
 mode and the worst one displayed (kcal/mol)

最后启动vina 进行分子对接:

在config目录中打开cmd->输入vina

其中：这条命令就是利用config.txt文件进行分子对接(cmd 必须在config文件目录下打开)

执行命令：

D:\Autodock\pdbqt>”D:\Vina\vina.exe” –receptor protein.pdbqt –ligand ligend.pdbqt –config config.txt –log log.txt –out output.pdbqt

“D:\Vina\vina.exe” –receptor selected_prediction_ready.pdbqt –ligand Conformer3D_CID_65536.pdbqt –config config.txt –log log.txt –out output.pdbqt

如果上述命令报错，一般是生成的config文件有问题：

正确的config内容如下：

执行完毕可以看到生成一个log文件

vina 中的affinity是亲合力结果排名

最后：

查看生成的模型：

将protein和output输出导入pymol

点击 all -> s查看表面结构

点击左右箭头查看不同的结构：

5.我们挑选第一个模型，看看结构方式是怎样的，见下图。很显然与真实的结合方式相差甚远，可以说是完全错误。

为什么会出现这种情况，很大程度上是因为search space太大，可能需要设置更大的exhaustiveness。

如果我们大致知道binding pocket在什么位置，那准确性应该会高不少，如何大致确定binding pocket的位置呢？我们接着试验。

可以通过实验的方式，比如某个点突变对结合或者活性影响非常大，那么大概率这个残基是结合口袋的一部分。

可以通过软件预测，比如蛋白与配体（底物）结合位点预测：https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COACH/

再比如Discovery studio软件（专业版的），可以很方便的根据受体分子的表面形状来预测结合口袋位置。

口袋的坐标为：

34.3356，14.9412，26.9615

我们修改下对接参数，新的参数如下：

receptor = r.pdbqt

ligand = nap.pdbqt

center_x = 34.3356

center_y = 14.9412

center_z = 26.9615

size_x = 30.0

size_y = 30.0

size_z = 30.0

energy_range = 4

exhaustiveness = 10

num_modes = 10

最优结果与真实模型的RMSD为1.795埃，可以说非常精准了

比对结果如下：

Souce: 纽普生物 2019-05-07

PyMOL 相关操作：

1、导入蛋白质

先在NCBI子数据库structure检索所需要的蛋白结构，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/?term=
记录下该蛋白的PDB ID，然后打开PyMOL，命令行输入：

fetch 5ocn#foxn1
fetch 3uf0#
fetch 1si4#血红蛋白

去除水分子

remove solvent

分离得到蛋白

remove organic

分离配体：

../_images/splitlig2020-03-12_202822.573956.png

pymol教程：

http://pymol.chenzhaoqiang.com/intro/startManual.html

分子对接进阶教程：选定对接位点区域：

如果我们想要将配体和蛋白质受体的某几个位点部位对接：

1、标记这些点 select->select from string ，选择对应的molecule和链，以及residue（寻找的位点），点击add

2、此时，会出现currenr selection ，选择该列中 c，点击绿点，会将对应的分子三D化。

3、接下来设置盒子，spacing 设置为1（相当于比例尺），xyz一般设置为20-22

这样就可以了。

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